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                链特异性转录组〓测序

                链特异性转录组测序

                非链特异性转录组测序信息不包含链方向的特征信息,对正ζ 义和反义转录本无法准确判断,导致无法反映真实的转录情况。而链特异性转录组测序(strand-specific RNA seq)可以解决这个问题。链特异性建库的方式是在合成cDNA的第二条Ψ链时,用dUTP替换dTTP。待链合成后,再用USER酶降解cDNA的第二条链并再次进行PCR扩增,完∴成文库的制备。运用这种方法,可以在测序后的数据分析过程中确定转录本是来自正义还是反义DNA链。与非链特异性转录组测序相比,此方法更能准确地统计▓转录本的数量和确定基因的结构,同♂时可以发现更多的反义转录本,目前被广泛地应用于研究基因结构和基因表达调控等领給我死域范围。

                链特异性建「库根据原核生物或真核生物的不同,建库方式略※有差别。同时,链特异性建库既可以用于有参物种的转录组测序也可用于无参物种的转录组测序。



                技术路线

                有参考基因组的转录组测序


                无参考基因组的◆转录组测序

                技术优势

                测序策略

                测序策略
                PE100或PE125
                建议▅数据量

                真核生物:一般测序5-6G深度测序10G

                原核生物:一般测序1G深度测序5-10G

                收样要求

                组织 500mg新鲜植物样本,300mg新鲜动物样本注: 肿瘤组织优先选择RNAlater保存
                细胞
                >5*106悬浮/贴壁细胞
                血液
                >3ml全血/全血分离的有核细胞
                RNA总量
                >3μg,浓度 >50ng/μl, RIN值>6.5
                对于较难进行取材的医学类样ζ品,可以适当降低样本标准。

                您可以①得到的数据分析

                有参链特异性转录组测序生物信息学分析流程

                常规分析
                高级分析

                高通量序列与参考基因组比对

                测序数据质控分析

                基因表达量分ω 析

                基因的可变剪切分析(真核生物)

                基因结构优化及新转录本预测

                SNP、InDel等基因结构变异筛查

                链方向性分析翻天覆地

                样本间基因差异表达分析

                差异表达』基因的KEGG和GO功能分析

                链特异性相关的定制分析

                差异基因的蛋白○互作分析

                个性¤化定制分析



                无参↑链特异性转录组测序生物信息学分析流程


                常规分析
                高级分析

                测序数据质控分析

                参考序列︾拼接

                Unigene的长度统计及功能注释

                Unigene的表々达谱构建

                SSR分析

                ORF预测

                SNPs分析

                序列信息统计

                链方向性分析

                Unigene在样本∏之间各类差异基因表达

                Unigene的KEGG和GO功能分析

                链特异性相关的定制分析


                差异基因的蛋☉白互作分析

                个性化定制分析


                案例解析

                运用链特异性转录组测序进行铬胁迫大米的顺式天然反义转录本分析

                (有参链特异性转录组测序)

                阐明新型的转录本和其顺式天然反义转录本(cis-NATs)的表达▆情况对于研究植物在应对和适应各种胁迫所发生的代谢□过程是十分必要的。非链特异性转录组测序无法提供链方向目標的信息,因此在鉴△定cis-NATs的过程中,必须采用链特←异性转录组测序。本研究探索铬处理大米样ㄨ品中cis-NATs的表达情况和其对应转录本在应对铬胁迫中起到的作用。结果表明,许多cis-NATs 都体现出了上调或者下调的趋势,35个与cis-NATs相关的基因位点在铬处理后的不同的组织和时间点组合显示了上调反应,表明cis-NATs根据环境变№化而变化。虽然cis-NATsRAP (大米→基因注释数据库)转录本的对应并非绝对明确,然而通过证明cis-NATs和大米的铬胁迫代谢反应相关,提升了对植物【环境胁迫反应的分子层面认知。


                Oono, Youko, et al. "Genome-wide analysis of rice cis-natural antisense transcription under cadmium exposure using strand-specific RNA-Seq." BMC genomics 18.1 (2017): 761.(Impact factor3.73)


                A. 铬处理24小时后表达上调的大米基因区域:Os05g0194500(红色标示)

                B. 链特异性测→序转录本的GO富集图,不同颜色代表不同的GO功能


                小鼠卵母细胞的深度测序和重新组装揭示转录作用对DNA甲基化起到的〖影响

                (无参链特异性转录组测序)

                先前研究并没有清晰地阐述在小鼠卵母细胞中转录作用对DNA甲基化产生的影响,原因之一嗤是没有应用链特异性测序方法,无卐法体现转录本的方向和确定可变的转录起始位点。本研究系统的探究了小鼠◥卵母细胞中々转录组与DNA甲基化的关系,利用嘴角掛起了不屑链特异性转录组测序和转录组重新组装的方法对小鼠卵母细胞形成的不同阶段(不生长期,生长期,8-14天,15天和完全生长的卵◥母细胞)进行了研究,揭示了上千个全新的mRNAs和可变启动子。重新组装后的转录组数据揭示了转录作用⊙的确与DNA甲基化密切相关,受ㄨ转录作用调控的DNA甲基化占全部甲基化□作用的85-90%。后续通过结合甲基化检测,ChIP-seq等方法,准确的定义了小鼠卵母细胞的转录组。本研究不仅在小鼠卵母细胞发生过程中将转录作用与♂DNA甲基化ㄨ建立了联系,同◥时也进一步地完善了小鼠卵母细胞的转录组图谱。


                Veselovska, Lenka, et al. "Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape." Genome biology (2015): 209. (Impact factor:11.9



                A. 链特异性转录组测序后的生物信息学分析流程,上方信息为不同卵母细胞发育时期】(N.G.O, G.O.1等),右边的条形图为各项分ぷ析后的转录本数量。

                B. 不同样品(卵母细胞,不同时◣期胚胎等)中转录本的表达聚类分析,左边竖条代表卵母细胞中特异表达的转录本(紫色)和非特异表达的转录本(黄色)。

                研究趋势与研究热点

                发掘新的circRNA和lncRNA。尤其是circRNA,因为它是由反向剪接形成,而非链特异性测序会使得可变剪↓接事件的识别存在假阳性而降低检测circRNA的准确率;
                研究顺式天然反义转录本(cis-NATs);
                无参考基因组或参考基因组不全的物种转录组图谱的构建或完善。

                常见问题

                链特异性建库和非链〗特异性建库有什么区别?

                1.链特异性文库可以提供RNA方向信息,以区分转录本是来源于』正义链还是反义链,避免了其互补链转录本重叠的干扰,使得基因定量更精确;
                2.链特异性文库可以提高反义链上非编码转录本的检出■率,同时也便于确定那些⌒ 位于基因间的非编码转录本的方向,这一点在普通转录组建库方法上很难实现;
                3.预测新转录本时需要进行组装,而转录组组装出来的unigene包含编码■转录本和非编码转录本(如lncRNA),如果不区分其转录本是正义链还是负义链,那么有互补配对关系¤的编码与非编码转录本就▽会被组装成一条转录本;
                4.原核生物的一旦打起來基因为多顺反子结构,如果不加区分反义转录本上的基因,其对应位置的基因表达量会计算不准确,操纵子及基因结构〇的预测也随之不准确。

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