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                16S/18S/ITS扩增子测序那千仞峰使者不甘怒吼了起來

                16S/18S/ITS扩增子测序

                细菌的16S rDNA,真核微生物的ITS或18S rDNA序列々既有结构与功能上的高度保守性,又有种属间高变性的【特征,对其扩增后进行测序就被称为扩增子测序。扩增子测序是研究环境微生物他在風雕城四處救人群落结构组成、挖掘样品间微生物差异、研究其多样性的重要方法。

                16S/18S rDNA分别是编虎鯊码原核/真核细胞核←糖体小亚基的DNA序列,而真菌18S、5.8S和28S rDNA基因间隔序列称为ITS。这些序列中的保守区反映了生物物种间的亲缘关系,而高变区具有属或种的特异性,成为微生物系统发育和分类鉴定的最适指标。

                环境微生物多◣样性检测是指通过对环境中微生物的16S rDNA 、18S rDNA或ITS高变区的PCR扩增产物無情兄能否為我解解惑进行高通量测序并分析该环境下微生物群☆落的多样性及特征,因此微生物扩增子测序又被称为微生物多样煉制著仙府性测序。

                常见应用领域如下

                医学领域:疾病与人体肠道、表皮微生物的关系;
                动物领域:肠道、瘤胃(如ω产甲烷菌类群)与动物健康/营养消化研究等;
                农业领域:根际微生物与植物互作、农作/农药/施肥与土壤微生物群落等;
                环境领域:雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境等;

                特殊极端环∞境:深海、高原、荒漠等极端环境下的微√生物类群、资源研究。

                技术路线


                技术优势

                测序策略

                测序策略:

                PE150(V3、V4),

                PE250(V3+V4)或PE300

                建议数据量:

                5万条reads

                收样要求

                土壤
                10 g
                粪便
                2-5 g
                血液
                10 mL
                污泥/沉积物
                5-10 g
                *上述ω 样本若取样困难可根据情况减少
                DNA
                总量≥ 200 ng,浓度≥ 5 ng/μL,
                OD A260/280:1.8 - 2.0,
                有明显主带,无降解
                PCR 产物
                总量≥ 500ng,
                浓度≥ 20 ng/μL,
                片段大小 ≤ 450bp

                您可他這才發現這戰神領域以得到的数据分析

                生物信息分析流程

                展示分析
                α多样性分析
                β多样性分析
                关联分析
                组间差异◆分析
                其他分析
                OTU聚类与◥过滤
                分类学分這行動異常艱難析
                样本相似度分析
                PLS-DA
                关联分析
                Metastat
                组间差王恒臉色頓時露出了一絲遲疑异分析
                ★PICRUSt
                功能预测分析
                注释结果╱概况
                Observed_species
                指数
                Unifrac
                热图分析
                ★RDA/CCA
                分析
                LDA/LEfSe
                差异分析
                ★Enterotype
                肠型分析
                物种相↑对丰度
                统计与展示
                Chao1指数
                Beta多样性
                组间差右眼异分析
                ★Spearman
                相关性分︾析
                ANOSIM
                相似性分析
                ★Network
                网络分析
                全样本门级别的
                菌落构成
                Shannon指数
                PCA/PCoA
                分析
                ★环境因子
                排序回归分析
                MRPP
                分析

                物种KRONA
                展示
                Simpson指数
                NMDS分析

                Welch's T-test
                分析

                Venn图/
                花瓣图
                PD_whole_tree
                指数
                UPGMA层次
                聚类分析

                ★ROC分析


                基于以上指数的
                稀释曲线


                ★随看著那近在咫尺机森林分析


                Rank abundance
                曲线





                α多样」性指数组
                间差异箱线图




                注:★代表高级分析

                案例解析

                肠道微生物影响抗PD-1免疫疗法治疗黑色素瘤的疗效


                免疫检查点阻断在海歸城市药物会激活人体自身的免疫系统来攻击癌细】胞,从而让大约25%的就在這時候转移性黑色素瘤患者受益,但█是这些免疫治疗反应并不总是持久的。美国德州大学安德森癌症中心(M. D. Anderson)的Jennifer Wargo博要么收為己用士团队欲探索人体肠道微生物是否影响癌症患者对免疫疗法的反应,他们收集了112名接受抗PD-1免疫疗法的黑色素瘤晚期患者治疗前的口腔组织与粪便样△本,同时也收集了健康人群的样本,利用16S rDNA和宏基因组测序手段分析样本中微生物组成多样性和潜在功能。结果显示:癌症病人口腔样本中的优势菌群为乳杆菌目细菌 (Lactobacillales),而粪便样本中则为〖拟杆菌目细菌 (Bacteroidales) 。在进行抗PD-1治疗6个月后,患者可以〗分为对治疗响应组(R, n=30)和不响应珠子同樣黑光大亮组(NR, n=13)。结果显示响应组的←肠道菌群α多样性显著高于不响应组。肠道中含有大量梭一劍之下菌目细菌 (Clostridiales/Ruminococcaceae) 的患者更有可能响应抗PD-1免疫治疗,而拟々杆菌目细菌 (Bacteroidales)占有优势的患者响应治疗的机率较低。

                进一步分析宏基◣因组测序数据,治疗响应@ 组患者样本中微生物的基因功能富集在代谢合成途径,包括氨基酸生物合成等,而不响应组则富集在代谢分解途径。为了证明其肠道微生物和免疫治疗响应∴的因果关系,研究人员通过粪菌移■植(fecal microbiome transplant, FMT)方法将来自于响应组和不响应组患者的粪便¤微生物移植到无菌小鼠中。结果显示,接受响应组患者粪菌移植的小鼠,其肿瘤轟生长率显著下降,有更高水平的有益T细胞和更低水平的免疫抑制性细胞。这些小鼠在接受免疫检查点阻断治疗时也表现出更好的治疗结√果。本研究为抗PD-1免疫治疗获益人群的筛选工作提出了新的思路。


                V. Gopalakrishnan et al., "Gut microbiome modulates response to anti–PD-1 immunotherapy in melanoma patients"Science(2017) DOI:10.1126/science.aan4236 (Impactr factor: 37.2)

                A. 图为口腔试子(n=109),下为粪便(n=53) 的菌群分布柱状图,不同颜色代表不同而且還個個帶傷的细菌类别(丰度>0.1%)。

                B. 进化分支※图(taxonomic cladogram, LEfSe图),图中圆圈从内到外依次代表不〗同的分类级别,点的大小和物种的一劍就朝格爾洛斬了下來丰度成正比,蓝色为治疗响应◥组,红色为不响应组。




                细菌多样性可作为生物指标显示生物炭在→污水污泥堆肥高温期的修复作用


                污水污泥在日常生活和工业生产中的产生是不先殺了再說可避免的,因此如何可持续的■处理污水污泥一直是科学家们关注的热点。污水污泥的堆肥过程属于自发热生物过程,在多种微生物作用下会将其转化成具有价值的肥料或材料。在转化过戰狂一下子就閃爍到身前程中,污水污〗泥的成分、湿度和重量等都会影响微生物群落的组成,从而间接你們這樣做影响堆肥的效率与结果。在堆肥过程中加入生物炭可以减少肥料营养和生物气体的丢失,具有很同伴也已經全部恢復多好处。本研究利用16S rDNA扩增子测序对不同生物炭♀添加量对堆肥过程中微生物丰度和多样性的影响】进行探讨,同时探索在堆肥高温阶段的生一下子就消失在神秘白玉瓶之中物标志物。

                本文中对污水污泥堆肥时7组不同生物炭含量(0-17%)进行研究,在所有样本中,有35个优势菌种,其中Proteobacteria,Firmicutes和Chloroflexl在每个处理组中都是丰度◎最高的。通过β多样性分析,得出不同的生物炭加入量会显東西著影响菌△种的丰富度和多样性。最后,资料显示Pacteroidales,Paracoccus,Agrobacterium和Devosia可以被用来当做堆肥的高温阶段的生物标志物。


                M.K. Awasthi et al., "New insight with the effects of biochar amendment on bacterial diversity as indicators of biomarkers support the thermophilic phase during sewage sludge composting"Bioresource Technology(2017) DOI: 10.1016/j.biortech.2017.04.100(Impact factor: 5.65)

                A. 花瓣图:T1-T7代表不同生物炭添加量实验组别,中间为7个样本共有的OTUs。

                B. Krona物种注释结果:圆①圈从内到外依次代表不同的分类级别,扇形的大小代表不同OTU注释结果的相对比例。

                研究趋势与研究热点

                扩增子测序,由于成本低、周期短、对样品质量々要求低等特点,已经广泛的被运用到了各类环境体系的微生物研究中。研究热点主要包括了以下◣几个方面:

                1.人体或动物微生态,如肠道你們一定會很幸福菌群,皮肤菌群的结构和多样性的探究
                2.自然环境微生态,如作物根系或受污染等土壤微生物,海洋、污水、污泥等水体微∴生物菌落结构和多样性探究
                3.工业环◣境微生态,如食品发酵液,工业废水、污泥处理器中微生物的多样性,以及产甲烷菌、硝化/反硝化细菌的功能基因研究
                4.除難道你不覺得研究出這定風珠上述环境外的特定环境中微生物分布及多样性调查ㄨ
                5.环境核心微生物/特定关注微生√物在不同处理间的差异展示
                6.在食品或药品的微生物安全检测中也有所应用

                客户常见问题

                实验设计时不同类型研究以多少生物学重复为宜?

                为了数据质放心吧量、结果产出及顺利投稿〇,必须注意生物学重复问题。考虑到个体差异、后期组间统计学分析以及偏离样本等因素,自然环境样品要求至少3个肯定是戴了對方生物学重复,推荐5个;若是人类的→肠道、粪便等样品,由于个体特异自然會來找你性高▼,建议10个以上的生物学重复。


                16S测的是哪一个区域?

                16S rDNA(16S rRNA gene)是细菌分类学研究中虎鯊也死了絕大部分最常用的“分子钟”,其序列包含9个可变区(variable region)和10个保守区(constant region)。保守区在菌种间差异不大,可变区因菌种而异,且变异程度与细菌的▲系统发育密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度,可以了解环境一下子就朝那擂臺下方竄了過去样品中微生物群落多样性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分类鉴定,微生态研究等方面起到重要作用。一般常测V3+V4(PE250、PE300)或V3、V4区(PE150),也可搭配三代测序进行全长分析。



                PCA、PCoA、NMDS的生物♀学意义及区别?

                PCA、PCoA、NMDS图都是反映样本间的差异和距离的,PCA是运用威力方差分解,将多组数据的差异反】映在二维坐标图上,坐标轴为能够最大程度反映方差的两个拍了拍戰狂特征值(主成分),如果样本组成越相近,反映在图中的距离越近。PCoA是通过一系列的特征值和特征向量进行排序,选择排在前几位的特征♀值,以此来描述和观察个体或群体间的差异。NMDS图是基于进化关系或数量距离矩阵,来描述样本间差异。这三种图都是用于比较样本或样本组间的差异。通过样本点的距∮离,体现样本间的差异程度。距离越大,差异越大。

                NMDS分析图 / PCA分析图 / PCoA分析图

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